單胺類化合物，如多巴胺、5-羟色胺、去甲腎上腺素、腎上腺素和組胺，是神經系統中重要的神經遞質，負責調控多種生理和認知功能，如運動、睡眠、獎賞和情緒等。單胺環路功能異常會引起抑郁症、帕金森氏症和舞蹈症等精神類或神經退行性疾病。囊泡單胺轉運蛋白（vesicular monoamine transporters, VMATs）将突觸前神經元合成的單胺類化合物轉運進分泌囊泡，這是單胺類神經遞質向突觸間隙有效釋放的前提。臨床上，VMATs已經被作為高血壓、亨廷頓氏舞蹈症等運動障礙、精神性焦慮以及精神性興奮劑濫用的潛在治療靶點。

哺乳動物中存在兩個VMAT家族成員，VMAT1（SLC18A1）和VMAT2（SLC18A2）。VMAT1蛋白僅在外周神經分泌細胞中表達，而VMAT2蛋白則在中樞和外周神經系統中廣泛表達并承擔主要的囊泡單胺轉運功能。因此，VMAT2是目前多種單胺異常相關疾病治療藥物的主要靶點。VMAT2的抑制劑丁苯那嗪（tetrabenazine, TBZ）及其衍生物氘代丁苯那嗪（deutetrabenazine）和缬苯那嗪（valbenazine）已經被FDA批準用于治療亨廷頓氏舞蹈症或遲發性運動障礙（tardive dyskinesia）；另一個VMAT2的抑制劑利血平（reserpine, RSP）則是最早的交感神經抑制類降壓藥。此前的研究顯示，TBZ及其衍生物和RSP對VMAT2的抑制機制不同：TBZ是非競争性抑制劑，而RSP是競争性抑制劑；而且，TBZ特異性抑制VMAT2，而RSP是VMAT1和VMAT2共同的抑制劑。然而，目前VMAT蛋白底物轉運和藥物作用的分子機制均不明确。

2023年11月1日， beat365官方网站張哲課題組和美國聖裘德兒童研究醫院李佳學課題組合作在Nature雜志發布了題為“Mechanisms of neurotransmitter transport and drug inhibition in human VMAT2”的研究論文。該工作首次報道了人源VMAT2蛋白結合抑制劑TBZ、RSP及其底物5-羟色胺（5-HT）的冷凍電鏡結構，揭示了兩種抑制劑發揮功能以及VMAT2轉運底物的分子機制（圖1）。

VMAT2蛋白的分子量僅約56 kDa且缺乏可溶結構域，這對使用冷凍電鏡技術進行結構解析提出了巨大的挑戰。作者采取融合蛋白的策略，将MBP蛋白剛性融合在VMAT2的N端，同時将與MBP特異性結合的DARPin蛋白融合在VMAT2的C端，從而增大了VMAT2的分子量并提高了蛋白的穩定性，借此獲得了VMAT2與幾種小分子複合物的高分辨率結構（2.9-3.7 Å）（圖1A）。作者首先解析了VMAT2結合TBZ的結構。在該結構中，VMAT2蛋白呈現lumen-facing構象，TBZ的結合将VMAT2進一步鎖定在occluded狀态，此時VMAT2對膜兩側均不開放，由此阻礙了底物的結合和轉運（圖1A）。此前的研究表明，VMAT2在cytoplasm-facing構象時與RSP的親和力較強，為了獲得與RSP的複合物結構，作者對VMAT2胞質側門控處關鍵氨基酸殘基進行了突變，最終解析了VMAT2突變體Y418S在cytoplasm-facing構象下與RSP以及底物5-HT的複合物結構。這兩個結構顯示，5-HT與RSP結合在VMAT2中的相同位點，由于RSP分子量較大，與VMAT2親和力較強，因此可以競争性抑制底物的結合和轉運（圖1A）。作者進一步通過比較兩種不同構象狀态的結構變化，提出了VMAT2利用alternating access方式轉運底物的工作模型（圖1B）。期間，作者利用大量的功能實驗驗證了VMAT2中的關鍵氨基酸殘基在抑制劑結合和底物轉運中的作用，極好地印證了結構方面的分析和發現，并闡明了TBZ特異性抑制VMAT2而非VMAT1的分子機制。總之，這項研究加深了人們對VMAT2及SLC18家族相關囊泡神經遞質轉運蛋白結構和功能機制的理解，并為針對這些蛋白質的藥物研發和改造提供了重要的參考。

圖1. VMAT2的藥物抑制及底物轉運機制。

美國聖裘德兒童研究醫院李佳學研究員和北京大學張哲研究員為本文共同通訊作者。美國聖裘德兒童研究醫院博士後Shabareesh Pidathala、北京大學前沿交叉學科研究院生命聯合中心2020級博士生廖述筠和美國聖裘德兒童研究醫院博士後戴亞鑫為本文共同第一作者。美國聖裘德兒童研究醫院李肖和張齊倫，以及張哲課題組前技術員龍昌坤對本文做出重要貢獻。另外，美國聖裘德兒童研究醫院細胞和組織成像中心的工作人員、beat365官方网站鄭鵬裡研究員及博士生簡舒怡也為本研究提供了幫助。本研究得到國家重點研發計劃重點專項、國家自然科學基金面上項目、生命科學聯合中心、膜生物學國家重點實驗室、beat365官方网站啟東産業創新基金、李革-趙甯生命科學青年研究基金、National Institutes of Health和ALSAC的資助；并依托beat365官方网站公共儀器中心鳳凰工程蛋白質平台的技術支持。

原文鍊接：https://www.nature.com/articles/s41586-023-06727-9