受精後，合子基因組最初處于沉默狀态，前幾輪細胞分裂主要依賴母源因子。在人類胚胎8細胞階段，合子基因組激活(ZGA, zygotic genome activation)，使得胚胎發育逐漸轉變為合子基因組調控。合子和早期胚胎卵裂球被稱為全能性細胞，具有最高的發育潛能，能夠形成一個完整生物個體，包括胚内外的所有組織。然而，如何在體外捕捉并維持人全能性幹細胞，該問題仍未被解決。

近年來，兩個研究小組已經成功使用化學小分子混合物培養了具有胚内和胚外發育潛能的鼠和人擴展型多能幹細胞（Expanded/extended pluripotent stem cell，EPSC）。^1,2這些細胞不表達典型的全能性相關基因，而是持續表達多能性基因。在分子特征和功能上與真正的全能性幹細胞相比仍有一定的差距。

2021年，北京大學杜鵬課題組通過抑制剪接體，首次成功捕獲并穩定培養了小鼠全能性幹細胞（mouse totipotent blastomere-like cells， mTBLCs）。³這些細胞在單細胞轉錄組、翻譯組、DNA甲基化組和染色質可及性方面展示了與體内2-4細胞全能性胚胎相似的分子特征。在體内外分化體系中顯示出強大的雙向發育潛能，能夠産生胚内和胚外組織。此後，其他幾個研究團隊通過不同化學小分子組合成功分離了其他類型的小鼠全能性幹細胞，包括totipotent potential stem cells （TPSCs）、totipotent-like stem cells（TLSCs）和chemically induced totipotent stem cells （ciTotiSCs）。 ^4-6

2022年，多個研究小組報導在5iLA或4CL等培養條件下，從人原始态多能幹細胞（naïve hESCs）中成功捕獲了一種新型的8細胞樣細胞（8CLCs）。^7,8這些細胞存在的比例極低（約0.2-2%），并且高表達經典的ZGA标志基因，如ZSCAN4和DUXA。然而，8CLCs并不穩定，無法在體外多次傳代。目前，具有最高發育潛能的人全能性細胞仍無法在體外穩定培養。

2024年6月5日，北京大學杜鵬課題組在Cell雜志在線發表了題為 Capturing Totipotency in Human Cells Through Spliceosome Repression 的研究論文。在這項研究中，作者通過抑制剪接體重編程人多能性幹細胞，成功捕獲了兩種人全能性狀态的細胞。第一種細胞是區别于8CLC的獨特ZGA-like細胞ZLCs（ZGA-like cells），該細胞随後可以轉變成為具有pre-ZGA特征的hTBLCs（human totipotent blastomere-like cells），并且能夠在體外穩定培養。

在本研究工作中，作者主要有以下發現：

1.剪接體瞬時抑制将人多能性幹細胞重編程為獨特的ZGA-like細胞（ZLCs）

首先，作者使用高濃度的剪接抑制劑Pladienolide B（PlaB）處理人始發态多能幹細胞（primed hESCs）。轉錄組分析顯示，在PlaB處理48h後，囊胚時期特異表達的基因顯著下調，包括多個經典的primed基因，如PODXL、DNMT3B、THY1等。同時，8細胞時期特有的基因，如GADD45A/B, MED26, SNAI1等得到顯著激活。細胞整體轉錄組與體内的ZGA時期8細胞胚胎/桑椹胚高度相似。此外，剪接因子SNRPD2的敲低實驗進一步驗證了剪接體抑制能夠激活ZGA基因并沉默多能性基因。這種類ZGA細胞被命名為ZLCs （ZGA-like cells）。

通過對8CLCs和ZLCs進行轉錄組比較，發現ZLC的轉錄組與已知的8CLC顯著不同。這兩種細胞類型都富集一組8細胞/桑椹胚特異性基因（common ZGA genes），如HIST1H2BG/BK、GADD45A/B和GPATCH3。然而，與8CLCs不同，ZLCs并不表達典型的ZGA基因如DUXA/B、ZSCAN4/5B、LEUTX和TPRX1 （8CLC ZGA genes），反而表達了一組在8CLCs中不激活的8細胞/桑椹胚特異性基因（ZLC ZGA genes），如ZNF23/34、FAM32A、HBEGF和MED26。更重要的是，ZLCs沉默了多數典型的naïve多能性基因，包括DNMT3L、TBX3、GPX2和ALPP，而這些基因在8CLCs中仍激活。進一步的單細胞轉錄組分析顯示，ZLCs在單細胞水平上廣泛且均一的激活了ZGA基因，并沉默了多能性基因，其轉錄組接近體内8細胞時期胚胎，區别于其他已知的hESCs或8CLCs（圖1）。

圖1. 剪接體瞬時抑制策略捕捉到一種新型的模拟人體内8細胞胚胎的ZGA-like細胞，該細胞不同于已報道的8CLCs

2. 剪接體持續抑制使多能性幹細胞轉變為ZLC-like的中間狀态，進而轉變為具有pre-ZGA特征的，能夠穩定傳代的人全能幹細胞（hTBLC）

由于高濃度PlaB短暫誘導的ZLCs無法長期維持，并會在幾天内迅速死亡，作者開發了一種新型MYCP培養基，其中包含低濃度的PlaB，不僅能夠穩定地培養細胞，且細胞保持着正常的核型，增殖速率以及細胞活率。有趣的是，轉錄組分析顯示，在P3/P4階段 ，common ZGA和ZLC ZGA基因被特異激活随後被迅速沉默。這些基因同時也在8細胞/桑葚胚以及高濃度PlaB誘導的ZLCs中激活，這意味着hESC在MYCP培養基中經曆了一個ZLC-like的中間狀态。大約在P10後，細胞整體轉錄組趨于穩定。與hESCs相比，這些細胞激活了一系列在合子和2-4細胞胚胎中特異富集的pre-ZGA基因如PLAGL1、ZNF337、SLC6A16、ZEB1、RFX4和ZBTB16， 并且廣泛沉默多能性基因。這種能夠穩定培養的細胞被命名為hTBLCs（human totipotent blastomere-like cells）(圖2)。

圖2.剪接體持續抑制使多能性幹細胞轉變為ZLC-like的中間狀态，進而轉變為具有pre-ZGA特征的hTBLC。

作者進一步對hTBLCs與之前報道的naïve/primed hESCs, hEPSC和8CLCs在轉錄組層面進行了系統比較。區别于所有已知的多種細胞，hTBLCs在轉錄組水平上具有獨特的pre-ZGA特征，特異激活在合子和2-4細胞胚胎特異表達的基因以及轉座子，并且廣泛的沉默多能性基因。此外，通過CHIP-seq以及ATAC-seq在組蛋白修飾以及染色質可及性水平鑒定了hTBLC的表觀特征，發現hTBLCs的H3K27me3修飾水平顯著降低，與體内早期胚胎H3K27me3的全局擦除相一緻。通過系統比較表觀基因組信号峰值，相較于hESCs,在hTBLCs中超過一半的增強以及減弱的峰與體内2-4細胞時期胚胎顯示出相似的狀态。綜上，通過使用轉錄組測序以及多組學分析，作者揭示了hTBLCs在轉錄組和表觀組水平上與體内早期胚胎相近的分子特征（圖3）。

圖3.與已知的各種細胞不同，hTBLCs在轉錄組水平上具有獨特的pre-ZGA特征。

3.基于hTBLCs的自發分化體系能夠模拟人着床前胚胎發育

基于穩定培養的hTBLCs，作者開發了一種無需額外細胞信号操控的自發分化體系。在此體系中，hTBLCs被接種在primed hESC培養基中。轉錄組分析顯示，pre-ZGA特異基因迅速沉默，細胞退出pre-ZGA狀态。4h後， 如DIO3、PPP1R15A、MED26和GADD45A等common ZGA和ZLC ZGA基因被瞬時激活，而8CLC ZGA基因并不表達。作者指出，在自發分化體系的4h-16h階段，細胞重新進入了一個ZLC-like的中間階段，與重編程過程中P3/P4的ZLC-like中間态以及高濃度PlaB瞬時誘導的ZLCs相似，且明顯區别于8CLCs（圖4）。

在随後的24-72h分化過程中，細胞并行地産生了胚内譜系上胚層EPI（epiblast），和胚外譜系原始内胚層PrE（primitive endoderm）和滋養層TE（trophectoderm）。72h後，包括OCT4,NANOG,DNMT3B等經典多能性基因穩定表達，标志着細胞最終回到了primed狀态。作為對照，在相同條件下，naïve hESCs無法産生胚外細胞譜系（圖4）。綜上，在沒有外部細胞信号操控的條件下，hTBLCs自發分化過程中，細胞首先經過一個ZLC-like中間狀态，随後經曆兩次細胞命運決定，生成EPI-like、TE-like和PrE-like的胚内外細胞譜系。這個自發分化體系不僅有力證明了hTBLCs具有獨有的pre-ZGA全能性，這是多能性細胞所不具備的，同時提供了一個用于模拟人胚胎着床前發育過程的體外分化體系。

圖4. 基于hTBLCs的自發分化體系能夠模拟人着床前胚胎發育

4.hTBLCs能夠在人胚胎培養基中産生類囊胚

近幾年來，研究人員通過使用naïve/primed多能幹細胞以及hEPSCs在化學小分子的作用下成功構建了人類囊胚。在本研究中，與現有的類囊胚構建體系不同，作者僅使用人胚胎培養基G2-plus，在不添加任何小分子的條件下，成功利用hTBLCs生成了類囊胚結構（圖5）。而naïve hESCs和hEPSCs在相同條件下未能形成類囊胚結構。免疫染色分析顯示hTBLCs類囊胚中CDX2⁺的TE-like細胞位于外層，OCT4⁺的ICM-like細胞聚集在内部，兩種細胞之間形成明顯的空腔。單細胞轉錄組分析進一步證明，由hTBLCs衍生的類囊胚主要由TE-like，PrE-like以及EPI-like三種細胞組成。單細胞整合分析顯示，hTBLCs類囊胚中的三種細胞譜系能夠與人類E5-E7階段囊胚中的對應細胞譜系良好整合，這證明了hTBLCs能夠形成與體内囊胚相近的類囊胚結構。

圖5. hTBLCs能夠在人胚胎培養基中, 在不添加任何小分子的條件下,産生類囊胚。

5.hTBLCs在體内外分化體系中均展現出雙向發育潛能

最後，作者使用體内分化體系畸胎瘤形成和小鼠嵌合實驗，以及體外分化體系拟胚體形成實驗來驗證hTBLCs的分化潛能。在拟胚體實驗中，hTBLCs能夠形成大小正常的拟胚體。在分化的第2-5天，hTBLCs特異激活了胚外細胞譜系PrE的特征基因，如GATA4/6, SOX17 和 COL4A1/2。在分化的第12-15天，hTBLCs展現出向内胚層肝細胞分化的偏好性。在畸胎瘤實驗中，hTBLCs能夠形成三胚層，并且分化出15種細胞類型。小鼠嵌合實驗表明，在E4.5,E6.5以及E10.5嵌合胚胎中，均可以在胚内以及胚外組織中同時檢測到hTBLCs的嵌合。這些分化實驗結果證明hTBLCs不僅能夠分化出三胚層中的多種功能性細胞，還能夠産生胚外細胞譜系。

綜上，此項研究首次捕獲了一種新型的ZGA-like細胞 （ZLCs）,并成功在體外穩定培養了具有pre-ZGA特征的人全能性幹細胞 (hTBLCs)。得益于其出色的分化潛能，hTBLCs作為體外分化體系中理想的“種子細胞”，能夠産生高質量的功能細胞，未來能夠廣泛應用于類器官研究以及再生醫學領域。此外，人和小鼠全能性幹細胞的成功培養揭示了剪接抑制可能作為一種通用策略，推動多物種幹細胞從多能性向全能性的轉變。

beat365官方网站/北大-清華生命科學聯合中心/北京大學核糖核酸北京研究中心的杜鵬教授為該論文的通訊作者。beat365官方网站博士後李詩雨，畢業博士生楊敏，博士後申輝，博士研究生丁力為本文的并列第一作者。beat365官方网站博士後呂學晖，博士研究生蔺可昕、已出站博士後翁建莉對本文有重要貢獻。該項工作得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金、北京市自然科學基金的支持。

原文鍊接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.05.010

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