線粒體是一種由雙層膜包被的細胞器，負責提供細胞進行各種生命活動所需的能量。線粒體的蛋白質穩态維持對于其功能的正常行使至關重要。AAA+ ATPases（ATPases associated with a variety of cellular activities）在線粒體蛋白質質量控制中發揮着重要的作用。在線粒體内膜上存在兩種AAA+ 蛋白酶複合物， m-AAA和i-AAA，它們分别朝向線粒體的基質（Matrix）和膜間隙（Intermembrane space，IMS），負責識别并降解線粒體複合物中錯誤組裝和損壞的亞基，以及一些錯誤定位的膜蛋白。

線粒體還具有另外一種定位于IMS的AAA+ ATPase—CLPB (Perier et al., 1995)。CLPB的N端具有一個在AAA+家族成員很少見的ANK（Ankyrin repeat）結構域，其C端是一個典型的AAA+ ATPase模塊。CLPB能夠發揮去聚集酶（Disaggregase）的活性，在維持IMS蛋白質組穩态中發揮了重要作用 (Cupo and Shorter, 2020)。CLPB基因的突變與人類疾病密切相關，如3-甲基戊烯二酸疾病（3-MGA) (Capo-Chichi et al., 2015; Cupo and Shorter, 2020; Kanabus et al., 2015; Kiykim et al., 2016; Mroz et al., 2020; Saunders et al., 2015; Thevarajan et al., 2020; Wortmann et al., 2015)和重症先天性中性粒細胞減少症（SCN）(Warren et al., 2022)。在急性髓細胞性白血病（AML）中，CLPB蛋白的表達上調還介導了細胞對BCL-2抑制劑Venetoclax的耐藥性 (Chen et al., 2019)。盡管CLPB對人類健康很重要，但現階段對CLPB發揮功能的機制和結構的研究較少，其獨特的ANK結構域的分子功能也并不清楚。

2023年2月6日，beat365官方网站高甯課題組與合作者于PLOS Biology在線發表了題為Comprehensive structural characterization of the human AAA+ disaggregase CLPB in the apo- and substrate-bound states reveals a unique mode of action driven by oligomerization的研究論文。該研究利用冷凍電鏡技術解析了人源CLPB在apo-和底物結合狀态的結構，揭示了其在處理底物過程中的兩種不同的寡聚狀态。研究發現，CLPB的ANK結構域不僅負責維持CLPB獨特高級組裝形式，而且對去聚集酶的活性也不可或缺。該研究還通過質譜組學證明ANK直接參與多種線粒體底物的直接相互作用。這些結果揭示了CLPB作為線粒體中通用性的去聚集酶的獨特生物物理性質，為以CLPB為靶點的各種線粒體相關疾病的藥物研發提供了重要信息。

圖1 apo-和底物結合狀态的CLPB結構

首先，作者解析了apo狀态CLPB的冷凍電鏡結構。與經典的AAA+蛋白不同，apo狀态的CLPB通過ANK結構域，以“頭對頭”的方式組裝成同源十四聚體（雙七聚體）。在apo狀态中，中央孔道是空的，整個複合物呈假D7次對稱。通過引入突變酶活性中心的突變（E425Q），作者解析了有内源底物結合的CLPB結構。驚奇的是，底物結合狀态的CLPB形成了同源十二聚體（雙六聚體）。與典型的AAA+ 蛋白質解聚酶或者去聚集酶類似，6個亞基呈螺旋階梯狀排列圍繞着底物。AAA+蛋白家族中，七聚體的組織形式非常罕見。為了排除異源表達系統可能引起的假象，作者首先在哺乳動物細胞表達了野生型和突變的CLPB（WT和E425Q），并結合負染電鏡分析其組裝形式。研究發現，與E. coli表達的蛋白質的多聚形式完全一樣：WT CLPB在不結合底物的情況下主要呈現雙七聚體的形式；在體外加入模式底物Casein，可以誘導CLPB從雙七聚體轉變為雙六聚體。這表明，雙七聚體構象可能是CLPB的靜息狀态；在底物存在的情況下，底物和CLPB複合物之間的相互作用促進雙六聚體的形成，而雙六聚體具備更高的ATPase活性，是去聚集酶的活性狀态。

由于雙七/六聚體複合物分子間和分子内的高度動态性，結構的整體分辨率有限，無法分析底物的具體結合細節。為了探索CLPB結合底物的分子機理，論文解析了單獨NBD的電鏡結構以及ANK的晶體結構。結構表明CLPB保守的底物結合Loop與底物直接相互作用，圍繞着底物呈螺旋階梯狀排列。基于ANK的高分辨結構，作者分析了介導雙層結構的ANK結構域的界面，發現界面的某些殘基的突變可以顯著的降低CLPB的去聚集酶活性。最後，利用LC-MS/MS技術，作者對CLPB ANK結構域的線粒體互作蛋白組進行了定性和定量的分析，揭示了ANK結構域對底物的識别和選擇。

圖2 CLPB的工作模型

綜上，本項工作利用冷凍電鏡結合生化、質譜等手段，對CLPB的結構和功能進行了系統性的研究，為理解CLPB在線粒體中發揮去聚集酶活性的分子機理提供了重要的理論基礎，為後續設計CLPB的抑制劑來治療相關疾病提供了重要的結構基礎。

beat365官方网站高甯教授、複旦大學beat365林金鐘教授為該論文的共同通訊作者，課題組吳大木博士研究生（2017級PTN）為本文的第一作者，劉燕博士（複旦大學）、戴餘浩（2020級PTN）、王國鵬博士、逯國亮博士（複旦大學）對文章做出了重要貢獻，陳燕博士、李甯甯博士在該工作中亦有貢獻。該研究得到了國家自然科學基金、國家重點研發計劃、啟東-SLS創新基金、北大-清華生命科學聯合中心、膜生物學國家重點實驗室、昌平實驗室的支持。北京大學冷凍電鏡平台、電鏡實驗室、高性能計算平台、beat365儀器中心及鳳凰工程蛋白質質譜平台等多個儀器平台對本項目提供了重要的技術支撐。

原文鍊接：https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001987

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