經典的細胞骨架是由微管（microtubule）、微絲（F-actin）或者中間絲組成的三維網絡結構，在細胞的穩定性維持、胞内物質運輸以及細胞運動方面發揮關鍵作用。除此之外，動物細胞中還存在一種以血影蛋白spectrin為基礎的二維網狀形式的膜骨架系統。膜骨架平行于細胞膜分布，緊貼在細胞膜内側，賦予細胞膜更高的機械強度和可塑性 (Lux, 2016)（圖1）。膜骨架與細胞膜的功能活動密切關聯：通過與膜蛋白的互作，膜骨架可以調控膜蛋白在細胞膜上的定位，促進膜蛋白聚簇形成高級組織形式，同時也參與調控細胞對外界信号的響應。上世紀60年代，膜骨架首先在紅細胞中發現，針對膜骨架的分子層面的研究也多以紅細胞為模型。随後在神經細胞、上皮細胞和淋巴細胞等多種細胞類型的細胞膜上也證實了膜骨架的存在及其功能的重要性。膜骨架在神經細胞中的組織形式和功能也有較多研究，在軸突起始段（axon initial segments）和郎氏結（nodes of Ranvier）的形成上起着關鍵作用。

圖1，紅細胞膜骨架示意圖

紅細胞的膜骨架整體上呈現六邊形為主的多邊形二維網格結構，而在軸突細胞膜上，膜骨架沿着軸突以一維周期性網格（quasi-1D periodic lattice）的形式排布。這些網格以一種特異的短的F-actin為網格節點，以spectrin四聚體為網格線；每一個節點上，F-actin作為集線器連結多條spectrin纖維，将其彙聚到一起（圖1）。多種F-actin結合蛋白進一步穩定這種連結并調控其功能，包括不同F-actin所通用的原肌球蛋白（tropomyosin）和原肌球調節蛋白（Tropomodulin，Tmod)，以及膜骨架特異的adducin、protein 4.1（P4.1）和dematin等。這種由actin、spectrin及輔助因子組成的網格節點稱為spectrin-actin junctional complex，是膜骨架的核心複合物。膜骨架主要通過兩個位點與膜蛋白建立連接 (Lux, 2016; Mankelow et al., 2012)：一是junctional complex通過P4.1、adducin、dematin與膜蛋白互作；二是在spectrin 纖維的中段，由另一種蛋白因子ankyrin與多種膜蛋白形成ankyrin complex (Bruce et al., 2003; Vallese et al., 2022; Xia et al., 2022)。

基于膜骨架在細胞膜的機械強度和代謝活動中的關鍵角色，其功能的紊亂與多種人類疾病密切相關 (An and Mohandas, 2008; Bennett and Healy, 2008)。Spectrin、ankyrin、P4.1等膜骨架組成因子的缺失或突變導緻多種遺傳性紅細胞異常疾病的發生；Ankyrin-B功能缺失的突變與一種遺傳性心律失常疾病直接相關，稱為ankyrin-B綜合征；Adducin的多種位點突變與高血壓具有高度的關聯性；此外，β-III-spectrin會導緻一種遺傳性的神經退行性疾病，spinocerebellar ataxia type 5。關于膜骨架核心複合物junctional complex的成分組成的研究工作較多，但是這些因子的精确的分子角色和功能機制有待進一步的研究，同時也尚不能排除該複合物是否含有更多未知的組成因子。目前領域内對junctional complex的結構研究相對滞後，缺乏高分辨的結構信息，這很大程度上限制了對其組成因子功能角色的深入理解。

2023年4月11日，beat365官方网站、生命科學聯合中心高甯/李甯甯課題組在Cell期刊在線發表了題為“Structural basis of membrane skeleton organization in red blood cells”的研究論文。經過大量的條件優化，課題組成功從豬血紅細胞中分離出了膜脂被完全清除、在冷凍電鏡條件下具有較好分散度的膜骨架網格（圖2），并對這一完整的内源膜骨架系統進行了冷凍電鏡結構分析，最終獲得了junctional complex的高分辨結構，揭示了junctional complex和膜骨架組裝的分子細節，闡釋了其組成因子在膜骨架組裝和穩定性維持方面的分子機制。

圖2，豬紅細胞的膜骨架冷凍電鏡原始成像圖片（紅色方框内為由多條spectrin纖維連接起來的兩個臨近的junctional complex）

從高分辨的三維結構中可以清楚地理解junctional complex的組織形式（圖3）。junctional complex全長約42 nm，核心部分是由12個actin亞基組成的6層的F-actin。在第1層到第5層（圖3中，從上到下）之間總共固定有8根spectrin 纖維。調控F-actin長度的Tmod單體和adducin四聚體分别扣在F-actin的兩端（pointed end和barbed end），阻止F-actin的延長或解聚。此外兩條tropomyosin coiled coil（TMCC）分别結合在F-actin的兩側，與Tmod和adducin也分别都有互相作用，三者共同決定了junctional complex的長度。在第2層到第5層之間，三個dematin分子以延展的結構環繞junctional complex的主幹部分，與多個actin和spectrin亞基互作。從整體上來看，junctional complex的組成因子都分别與内部的多個亞基互作，構成了一個錯綜複雜的相互作用網絡，共同維持了spectrin-actin連結的結構穩定性。關于junctional complex各個組分包括actin、spectrin、adducin的分子比例，此前也是領域争論的一個焦點，這項工作的結構部分也明确了各個組成因子在複合物中的化學計量比以及寡聚形式。

圖3，Spectrin-actin junctional complex冷凍電鏡結構

除此之外，這項工作還有多個重要的新發現：（1）從結構中鑒定了junctional complex的一個新的組成因子SH3BGRL2，同Tmod共同組成了一個完整的帽子結構結合在F-actin的pointed end，以維持F-actin的穩定性。該工作通過體内pull-down實驗進一步驗證了HEK293細胞的Tmod-F-actin複合物中也存在SH3BGRL2。結合已有的SH3BGRL2的研究數據，該工作的研究表明SH3BGRL2可能是F-actin系統通用的pointed end結合蛋白。（2）adducin作為一種F-actin的帽子蛋白，其四聚體的主體部分結合在F-actin的barbed end以維持複合物的穩定。但與此同時，adducin的N末端和C末端伸出四個類似觸手的柔性序列分别結合在F-actin 的第5層和第6層上，與actin及spectrin互作。這一結構信息一方面解釋了此前研究中發現的adducin促進spectrin和actin結合的功能，另一方面adducin的觸手占據了第5層和第6層上的spectrin和dematin結合位點，從而構成了決定junctional complex上spectrin和dematin分子數量的一個關鍵因素。（3）在以往所有的F-actin結構中，tropomyosin主要通過與actin直接互作的方式對稱地結合在F-actin兩側。但在junctional complex中，tropomyosin主要通過與spectrin、dematin、adducin互作間接地結合在F-actin纖維上，表明該工作發現了一種新的tropomyosin與F-actin的結合模式（圖4）。

圖4，Junctional complex中TMCC與F-actin間接結合

進一步的結構分析發現，junctional complex的組成元件存在多種層面的功能冗餘性。（1）紅細胞膜骨架主要呈六邊形網格，但junctional complex卻含有8條spectrin 纖維，即每個網格節點可以發出8條可用的網格線；（2）adducin四聚體共含有8條可結合actin的類似觸手的柔性序列，但複合物中僅需要四條柔性序列的結合；（3）junctional complex的tropomyosin含有兩種亞型，可以同二聚體或異二聚體的形式組成TMCC，降低了一種亞型異常對複合物穩定性帶來的影響；（4）Dematin是穩定junctional complex的關鍵因子，複合物中結合有三個dematin分子，但卻含有7個dematin 的C端 headpiece結構域的結合位點，有利于dematin的快速結合。這種多層次的冗餘性可能是一種故障保險機制，保證了膜骨架組裝的魯棒性，并為膜骨架的變形提供了支持。

綜上，該工作解析了紅細胞膜骨架的核心複合物spectrin-actin junctional complex的高分辨結構，為理解膜骨架的組裝和動态性以及其組成元件在膜骨架穩定和調控中的分子機制提供了一個結構框架。多個junctional complex的組成因子都屬于通用性的F-actin結合蛋白，因此該工作的研究結果也為其它的F-actin系統提供了重要的結構和機制信息。此外，值得一提的是，膜骨架的樣品極度不均一（圖2），對顆粒挑選和高分辨結構計算都有很大的幹擾，該工作的數據處理流程也為 “半純化的”（semi-purified）的複雜生物樣品的結構研究提供了一種新思路。

beat365官方网站高甯教授和李甯甯副研究員為本文的共同通訊作者，李甯甯和前沿交叉學科研究院博士研究生陳思伊（昌平實驗室研究生項目）為本文的共同第一作者。清華大學beat365張強鋒教授和課題組博士後徐魁、北京生命科學研究所董夢秋研究員和課題組博士生何夢婷也參與了這項工作。該研究得到了膜生物學國家重點實驗室、北大-清華生命科學聯合中心、昌平實驗室、國家自然科學基金、國家重點研發計劃、啟東-SLS創新基金的支持。北京大學電鏡實驗室、冷凍電鏡平台、高性能計算平台、beat365儀器中心及國家蛋白質基礎設施（北大分平台）對本項目提供了重要的技術支撐。

原文鍊接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)00278-7

參考文獻：

An, X., and Mohandas, N. (2008). Disorders of red cell membrane. Br J Haematol 141, 367-375.

Bennett, V., and Healy, J. (2008). Organizing the fluid membrane bilayer: diseases linked to spectrin and ankyrin. Trends in Molecular Medicine 14, 28-36.

Bruce, L.J., Beckmann, R., Ribeiro, M.L., Peters, L.L., Chasis, J.A., Delaunay, J., Mohandas, N., Anstee, D.J., and Tanner, M.J. (2003). A band 3-based macrocomplex of integral and peripheral proteins in the RBC membrane. Blood 101, 4180-4188.

Lux, S.E.t. (2016). Anatomy of the red cell membrane skeleton: unanswered questions. Blood 127, 187-199.

Mankelow, T.J., Satchwell, T.J., and Burton, N.M. (2012). Refined views of multi-protein complexes in the erythrocyte membrane. Blood Cells Mol Dis 49, 1-10.

Vallese, F., Kim, K., Yen, L.Y., Johnston, J.D., Noble, A.J., Cali, T., and Clarke, O.B. (2022). Architecture of the human erythrocyte ankyrin-1 complex. Nat Struct Mol Biol 29, 706-718.

Xia, X., Liu, S., and Zhou, Z.H. (2022). Structure, dynamics and assembly of the ankyrin complex on human red blood cell membrane. Nat Struct Mol Biol 29, 698-705.